Sự phát triển của cà phê dưới góc nhìn sinh thái hóa học

CFRR – Hương vị và mùi thơm của cà phê có lẽ nằm dưới sự kiểm soát gen và bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường

Các chất chuyển hóa thứ cấp chính trong cà phê

Danh mục hóa chất thực vật của cà phê rất lớn (Viani, 1988; Baumann và Seitz, 1992; Clarke và Vitzthum, 2001); tuy nhiên, liên quan đến sinh thái hóa học, cho đến nay chỉ có một số hợp chất cà phê nổi bật nhất được nghiên cứu chuyên sâu, đó là caffeine, axit chlorogen và trigonelline. 

Cuối cùng, trigonelline là một dẫn xuất của axit nicotinic và ảnh hưởng đến nhiều sự kiện trong đời sống thực vật (Minorsky, 2002): nó là chất điều hòa giống như hormone của chu kỳ tế bào và bắt giữ các tế bào trong giai đoạn trước khi nguyên phân (G2); nó được cho là một chất truyền tín hiệu trong phản ứng với stress oxy hóa; nó có thể hoạt động như một chất điều hòa thẩm thấu. Ngoài ra, trigonelline đã được chứng minh là hoạt động như một nguồn dự trữ để tổng hợp coenzyme (NAD) trong quá trình nảy mầm hạt cà phê sớm (Shimizu và Mazzafera, 2000). Không có báo cáo nào liên quan đến đặc tính bảo vệ hóa học của trigonelline, mặc dù nồng độ đáng kể của nó khoảng 1% (trọng lượng khô) trong cả hạt và lá, và thậm chí cao hơn ở lóng non nhất (>2%), điều này cho thấy sự vận chuyển từ lá già sang lá non (Kende, 1960).

Từ hạt giống đến cây non

Sinh thái sinh hóa cũng là vấn đề không gian và thời gian. Do đó phải giải quyết các câu hỏi như ‘cà phê được phân tán như thế nào và ở đâu?’, ‘mất bao lâu để có hạt nảy mầm?’, hoặc ‘điều gì xảy ra trong quá trình chuyển đổi từ hạt thành cây hoàn chỉnh?’. Hầu hết các kết quả được trích dẫn dưới đây thu được từ các nghiên cứu về cà phê arabica nhưng, được sửa đổi đôi chút, cũng áp dụng cho cà phê robusta.

Hạt cà phê xanh nhanh chóng mất khả năng nảy mầm khi được thu hoạch và chế biến, tùy thuộc vào độ ẩm của hạt và nhiệt độ trong quá trình bảo quản. Nói chung, trong vòng 3 tháng sau khi thu hoạch và chế biến, tỷ lệ nảy mầm giảm xuống bằng 0, nhưng được kéo dài đến cả năm hoặc lâu hơn ở 18 độ C, khi hàm lượng nước trong hạt không bao giờ giảm xuống dưới 40%, đạt được bằng cách bảo quản hạt trong điều kiện đóng gói chân không, đựng trong túi polyetylen (Valio, 1976; Couturon, 1980; Van der Vossen, 1980). 

Trong điều kiện tự nhiên, hạt cà phê sẽ không hoặc rất hiếm khi tiếp xúc trực tiếp với đất, bởi vì các loài động vật phát tán hạt giống (khỉ, voi, các loài chim lớn) bị thu hút bởi những quả cà phê đỏ, bùi và ngọt sau khi ăn chúng, bài tiết hoặc trào ngược hạt vẫn còn được bao phủ bởi lớp vỏ quả cứng, có thể nói là cà phê thóc, vì nó cũng là kết quả kỹ thuật của quá trình chế biến ướt. Đôi khi, toàn bộ quả bị phân tán hoặc rơi xuống dưới gốc cây cà phê. Sau đó, quả cà phê sẽ khô và co lại rất chậm, trông giống như cà phê chế biến khô trước khi tách vỏ. Hạt bên trong quả teo thậm chí còn được bảo vệ tốt hơn và ít mất nước hơn so với cà phê thóc.

Trong mọi trường hợp, điều kiện tự nhiên thuận lợi có độ ẩm, hạt sẽ hút nước và nảy mầm, xuyên qua lớp vỏ bên ngoài được tạo thành từ giấy da hoặc vỏ trấu hoàn chỉnh. Cuối cùng, quay trở lại với người làm vườn đã bổ sung thêm điều sau: hạt trần sẽ nảy mầm sớm hơn (khoảng 2 tuần) so với hạt trong đất khô, nhưng có nguy cơ bị sâu bệnh và mầm bệnh trong đất tấn công cao hơn trong quá trình trồng, hấp thụ và nảy mầm. Mặc dù caffeine được mô tả là một tác nhân hiệu quả chống lại tất cả các loại sinh vật (tổng quát), một số chuyên gia đã vượt qua cơ chế phòng vệ và không chỉ giải độc mà còn có thể chuyển hóa PuA cho nhu cầu của chính họ.

Chúng ta hãy quay trở lại vấn đề nảy mầm: Điều thú vị nhất là, trong quá trình hấp thụ nước (hấp thụ), caffeine gần như cố định hoàn toàn bên trong hạt, rất có thể là do hàng rào caffeine hiệu quả trên bề mặt của nó được tạo ra từ axit chlorogenic (Dentan, 1985). Như sẽ được trình bày dưới đây, các hợp chất phenolic này có tầm quan trọng quyết định trong toàn bộ vòng đời của cây cà phê, vì chúng ngăn cản quá trình tự nhiễm độc của caffeine. Chỉ khi rễ mầm (rễ non sơ cấp dày) phát triển thành chất nền, caffeine mới được giải phóng ở nồng độ cao vào môi trường (Baumann và Gabriel, 1984).

Rõ ràng, trong điều kiện tự nhiên, hạt cà phê hấp thụ được bao bọc an toàn – không cần phải bài tiết hợp chất bảo vệ caffeine – trong khi ở giai đoạn sau của quá trình nảy mầm, khoảng một phần ba lượng caffein của cây con, lúc này đã tiếp xúc với mầm bệnh và động vật ăn thịt, bị rò rỉ qua bề mặt rễ vào chất nền, nơi nó có thể ức chế sự cạnh tranh của các loài thực vật khác và chuẩn bị, cùng với các hợp chất khác, con đường cho vi sinh vật xâm lấn rễ cụ thể.

Từ nụ đến lá

Bây giờ, 50–60 ngày sau khi xuất hiện, chiếc lá đã phát triển đầy đủ và thu thập tối ưu năng lượng ánh sáng mặt trời cho sự hình thành đường từ carbon dioxide và nước, hay nói cách khác, quá trình quang hợp ròng đã đạt đến mức tối đa khi nó tồn tại trong một thời gian dài (Frischknecht và cộng sự, 1982; Mosli Waldhauser và cộng sự, 1997). Trong điều kiện tự nhiên và thuận lợi, thời gian sống của lá cà phê kéo dài từ 10–15 tháng (Van der Vossen và Browning, 1978). Sau đó, quá trình lão hóa bắt đầu và cuối cùng là rụng lá.

Nếu chúng ta lướt qua quá trình đồng thời của các hợp chất thứ cấp chính, chúng ta sẽ thấy nồng độ PuA và axit chlorogen trong lá cao đặc biệt ngay khi những chiếc lá rất mềm, giàu chất dinh dưỡng rời khỏi chồi bảo vệ cơ học, điều này có thể dễ dàng giải thích bởi nguy cơ cao bị ăn thịt bởi các loài côn trùng thực vật (Frischknecht và cộng sự, 1986). Ở giai đoạn này, cả enzyme (methyltransferase) tham gia vào quá trình sinh tổng hợp caffeine và enzyme chủ chốt của quá trình tổng hợp phenylpropane, phenylalanine amoniac lyase (PAL), đều có hoạt tính rất cao (Aerts và Baumann, 1994; Mosli Waldhauser và cộng sự, 1997). Nồng độ alkaloid của lá tăng gần 0,1 M (liên quan đến nước mô) và do đó có nồng độ gấp khoảng 10 lần so với cà phê espresso.

Tốc độ tổng hợp của cả caffeine và axit chlorogen giảm mạnh trong quá trình mở rộng lá tiếp theo. Hàm lượng caffeine tương đối giảm bởi sự tăng trưởng. Tuy nhiên, lượng caffeine tuyệt đối trên mỗi lá tăng đều đặn do hoạt động của enzyme thấp vẫn tồn tại trong suốt thời gian lá phát triển (Mosli Waldhauser và cộng sự, 1997). Lá cà phê phát triển đầy đủ, trên cơ sở trọng lượng khô, có hàm lượng caffeine trong phạm vi hạt cà phê. Thật ngạc nhiên, các axit chlorogenic, mặc dù được hình thành song song với caffeine, vẫn tiếp tục tăng trong sáu tuần tiếp theo (Kappeler, 1988). Lá rụng đã được báo cáo là không chứa caffeine, cho thấy rằng nitơ caffeine được cây sử dụng lại. 

Sự hình thành phối hợp của cả ancaloit (chủ yếu là caffeine) và axit chlorogen (chủ yếu là 5-CQA) có ý nghĩa sinh lý: caffeine dễ dàng thấm qua tất cả các loại rào cản sinh học, ngoại trừ một số do chính thực vật chứa caffeine tạo ra (ví dụ, bề mặt của hạt cà phê đã đề cập ở trên). Để tránh hiện tượng tự nhiễm độc, caffeine được tạo phức hợp hóa-lý bởi 5-CQA, và được ngăn trong không bào của tế bào (Mosli Waldhauser và Baumann, 1996). Vì axit chlorogen được bao bọc trong các tế bào nơi nó được tổng hợp, nên người ta phải giả định rằng caffeine, do tính chất ưa nước và ưa mỡ, cũng như khả năng tạo phức của nó, di chuyển từ từ trong cây cà phê tới các vị trí tích tụ nhiều axit chlorogen.

Nói cách khác, caffeine bị xáo trộn một cách thụ động và có thể nói là được thu thập trong cây theo tỷ lệ với nồng độ axit chlorogen trong mô. Rõ ràng, cây cà phê kiểm soát sự phân phối caffeine bằng cách phân bổ axit chlorogenic. Điều này được minh họa độc đáo bởi sự phân bố không đồng đều của caffeine trong lớp mỏng của lá cà phê: nó được tích lũy nhiều ở rìa và giảm mạnh về nồng độ ở phần giữa và các axit chlorogenic cho thấy mô hình phân phối giống nhau. Về mặt sinh thái sinh hóa, điều quan trọng cần lưu ý là cấu trúc lá hóa thực vật này rất có ý nghĩa: mép lá, nơi côn trùng tấn công ưu tiên, đặc biệt được trang bị đầy đủ các hợp chất phòng thủ quan trọng. Liệu cấu trúc lá hóa thực vật có được kiểm soát về mặt di truyền hay không và có thể bị ảnh hưởng bởi việc nhân giống hay không vẫn còn phải nghiên cứu.

Từ hoa đến quả

Khoảng thời gian giữa lúc nở hoa và quả chín hoàn toàn tùy theo loài và khác nhau đáng kể giữa các loài cà phê. Nó phụ thuộc nhiều hơn vào kiểu gen và điều kiện khí hậu. Các loài quan trọng về kinh tế như C. arabica và C. canephora lần lượt cần 6–8 và 9–11 tháng để trưởng thành (Guerreiro Filho, 1992).

Đúng như dự đoán, tất cả các cơ quan của hoa đều chứa caffeine alkaloid purine, với nồng độ cao nhất trong nhị hoa. Đáng ngạc nhiên, chất thứ hai tích lũy, bên cạnh dấu vết của theobromine, một lượng theophylline dễ dàng phát hiện được, cho thấy một con đường sinh tổng hợp thay thế ở bộ phận đực của hoa với theophylline là tiền chất trực tiếp của caffeine. Trong lá và hạt, quá trình sinh tổng hợp caffein đã được chứng minh là tiến hành thông qua theobromine. Tương tự như cây có múi, nơi nồng độ caffeine cao nhất được tìm thấy trong phấn hoa giàu protein (Kretschmar và Baumann, 1999), chúng ta có thể giả định rằng PuA cũng được ưu tiên phân bổ cho hạt phấn cà phê. Tuy nhiên, các phân tích liên quan vẫn chưa được thực hiện.

Ở cực trên trục (về phía cuống quả) của mỗi hạt, người ta có thể thấy sự khởi đầu của sự phát triển nội nhũ: một mô màu trắng, rất mềm (còn gọi là nội nhũ lỏng) bắt đầu xâm nhập và hấp thụ hạt ngoại nhũ. Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng các chất chuyển hóa của perisperm như đường và axit hữu cơ rất có thể được nội nhũ thu nhận (Rogers và cộng sự, 1999b). Chúng ta có thể cho rằng quá trình này tương tự như quá trình xâm nhập của lá mầm vào nội nhũ trong quá trình nảy mầm được mô tả ở trên: các chất chuyển hóa chuyển từ mô này sang mô khác, theo đó chúng phải đi qua cái gọi là apoplast, tức là không gian ngoại bào giữa các mô tế bào. – và nội nhũ trong quá trình phát triển của hạt, và giữa nội nhũ và lá mầm trong quá trình nảy mầm. Tuy nhiên, nội nhũ không chỉ là một đốm đơn giản của ngoại nhũ, vì nó có các hoạt động sinh tổng hợp cao. Tóm lại, và nói một cách triết học, trong cà phê, con đường đến thế hệ tiếp theo được đặc trưng bởi sự chuyển đổi trong đó các chất chuyển hóa được xáo trộn khoảng hai lần.

Trong quá trình xâm lấn này, lớp bên trong (nội quả) của thành quả (vỏ quả) ngày càng rắn chắc và sau đó tạo thành lớp vỏ quả như mô tả ở trên. Bản thân khả năng bảo vệ cơ học của nội nhũ được tăng lên đáng kể nhờ sự hình thành của các thành tế bào dày bên cạnh cellulose, cái gọi là hemicelluloses, tức là arabinogalactan và galactomannan (Bradbury, 2001). Hemiaellulose là các polysacarit có độ phức tạp cao, chủ yếu nổi tiếng vì mang lại độ cứng đáng kinh ngạc. Cần phải đề cập rằng hạt cà phê cuối cùng sẽ teo lại thành lớp vỏ hạt mỏng, lớp vỏ bạc, rơi ra trong quá trình rang.

Mặc dù có rất nhiều ấn phẩm về sinh tổng hợp caffeine (Ashihara và Crozier, 1999), vấn đề này chưa bao giờ được giải quyết và do đó chúng ta chỉ có thể suy đoán về nó. Rõ ràng, nội nhũ có một khả năng sinh tổng hợp nhất định đối với caffeine. Nhưng đây có phải là tất cả? Có sự đóng góp của các nguồn khác? Perisperm cung cấp khoảng một phần ba lượng caffeine trong hạt giống như ước tính từ hàm lượng caffeine của hạt perisperm (xem Hình 10.5 trong (Sondahl và Baumann, 2001). Lá không trực tiếp góp phần tạo ra caffeine trong hạt, nhưng vỏ quả có thể là một nguồn có giá trị (Keller và cộng sự, 1972; Sondahl và Baumann, 2001). Rõ ràng, caffeine di chuyển từ thành quả vào hạt đang phát triển, rất có thể là do nồng độ cao của axit chlorogenic được phân bổ cho ngoại nhũ/nội nhũ. Thật không may, mức độ vận chuyển caffeine này vẫn chưa được biết.

Có thể hình dung, tỷ lệ này phụ thuộc vào cả thời gian phát triển của quả và sự phân bổ axit chlorogen tương ứng lớn hơn ở loài chín chậm với tỷ lệ hạt so với axit chlorogen vỏ quả. Một lần nữa, quá trình tổng hợp, vận chuyển và tích lũy axit chlorogenic cuối cùng sẽ xác định vị trí và lượng caffeine được phân bổ trong hạt. Tóm lại, perisperm và pericarp chắc chắn là những nguồn quan trọng của caffeine trong hạt. Trong khi lá, màng ngoài và có lẽ cả perisperm màu xanh lục có thể cung cấp hầu hết các axit chlorogenic rất quan trọng để thu thập và cố định chắc chắn caffeine vào hạt cà phê. Tuy nhiên, mức độ đóng góp từ mỗi bên (mô mẹ so với nội nhũ và phôi) vẫn chưa được biết.

Di truyền phân tử của cà phê

Nghiên cứu về các giống cà phê arabica có hai phức tạp chính: một là lịch sử và một là sinh học. Theo báo cáo của Berthaud và Charrier (1988), hầu hết các giống cây trồng đều có nguồn gốc từ một số ít thực vật sống sót sau quá trình vận chuyển từ Yemen đến Nam Á và đến Trung và Nam Mỹ qua Châu Âu. Do đó, cơ sở di truyền của các giống cây trồng chính khá hạn chế và tính đa dạng tổng thể là kém. Để khắc phục vấn đề này và để giới thiệu các gen mới có giá trị, một số phép lai khác loài đã được thực hiện; Arabusta, Icatu` và Catimor là những giống lai nổi tiếng (Capot, 1972; Carvalho, 1988). Biến chứng sinh học là do khả năng tự thụ tinh của C. arabica, giúp tăng cường tính đồng nhất di truyền.

Số lượng tương đối nhỏ các nghiên cứu cơ bản về cà phê đã phần nào được mở rộng nhờ những phát triển kỹ thuật gần đây và nhờ sự gia tăng vừa phải các nghiên cứu khoa học. Động lực mới đã đạt được thông qua sự ra đời của bộ gen. Các kỹ thuật giải trình tự DNA hiện đã phổ biến ở hầu hết các phòng thí nghiệm và bộ gen của Coffea arabica (xem Bảng thuật ngữ ở cuối phần này để biết các từ kỹ thuật) đã được xem xét để phân tích trên quy mô lớn.

Bộ gen

Bộ gen của C. arabica bao gồm 44 nhiễm sắc thể nhỏ (2n = 4x), gấp đôi số lượng nhiễm sắc thể của C. canephora và tất cả các loài Coffea khác (Krug và Mendes, 1940; Bouharmount, 1959; Kammacher và Capot, 1972; Charrier , 1978; de Kochko và cộng sự, 2001). C. arabica là một loài thực vật dị bội được hình thành bởi sự hợp nhất tự phát giữa bộ gen của C. canephora, với tư cách là bố mẹ đực và bộ gen của một cây thuộc nhóm C. eugenioides với tư cách là bố mẹ cái (Lashermes và cộng sự, 1999). Thật vậy, tổng lượng DNA trên mỗi nhân trong arabica (2.6 pg, khoảng 2.4×10⁹ cặp bazơ) nhiều gấp đôi so với bất kỳ loại cà phê nào khác (Cros và cộng sự, 1995). Sự giao thoa giữa các loài xảy ra cách đây chưa đầy một triệu năm và do đó, loài này nên được coi là gần đây về mặt tiến hóa.

Nếu C. arabica là một loài tương đối trẻ, thì hai bộ gen của tổ tiên lẽ ra phải duy trì tính cá thể của chúng với ít sự tái phân bổ gen giữa các nhiễm sắc thể có nguồn gốc khác nhau (các nhiễm sắc thể tương tự giữa hai bộ gen này được cho là tương đồng). Lashermes và cộng sự (2000a), người đã nghiên cứu sự di truyền của các gen đơn lẻ trong sinh vật thể song bội này. Họ đã tìm thấy một sự di truyền bất bình thường, giống như ở bất kỳ loài lưỡng bội nào khác. Tuy nhiên, arabica phải có ít nhất bốn bản sao của mỗi gen, hai bản sao bắt nguồn từ tổ tiên canephora và hai bản sao bắt nguồn từ tổ tiên eugenioides. Cũng hợp lý khi cho rằng các cặp locus chỉnh hình (các gen tương ứng trên các nhiễm sắc thể tương đồng) có thể hơi khác nhau. Do đó, tính đồng hợp tử được tạo ra bởi đặc tính tự thụ tinh của sinh vật này có lẽ được bù đắp bởi tính dị hợp tử cấu thành do hai bộ gen của tổ tiên mang lại.

Lưu ý cuối cùng, điều quan trọng cần đề cập là không tồn tại bản đồ di truyền của C. arabica. Tuy nhiên, hiện có các bản đồ mật độ thấp của C. canephora và các cá thể lai khác loài (Paillard và cộng sự, 1996; Ky và cộng sự, 2000; Lashermes và cộng sự, 2001; Herrera và cộng sự, 2002). Ngoài mức độ nghiên cứu tương đối thấp được đề cập ở trên, việc thiếu bản đồ arabica còn do một số lý do: sự phức tạp của bộ gen tứ bội có nguồn gốc gần đây, mức độ đồng hợp tử cao và cuối cùng nhưng không kém phần quan trọng là số lượng thấp của các đa hình có sẵn.

DNA và đa dạng phân tử

Đa hình DNA là một công cụ quan trọng để nghiên cứu bộ gen và chúng đã cho phép xác định và lập bản đồ các gen biểu hiện ở nhiều sinh vật. Mặc dù rất khó để xác định các gen chịu trách nhiệm về một tính trạng nhất định, nhưng tính đa hình liên quan đến một gen thú vị có thể dễ dàng theo dõi qua các thế hệ và phép lai khác nhau để hỗ trợ các nhà lai tạo trong các quy trình chọn lọc và xâm nhập của họ. Ngoài ra, trong vài năm qua, bộ gen của C. arabica đã trải qua các dự án sàng lọc nhằm xác định tính đa hình.

Cross và cộng sự (1993); Lashermes và cộng sự (1996b) đã báo cáo việc xác định nhiều đa hình chiều dài đoạn giới hạn (RFLPs) ở các loài cà phê khác nhau. Cách tiếp cận này phát hiện các biến thể trình tự, thường là các đột biến cơ sở đơn lẻ và liên quan đến quá trình tiêu hóa DNA bằng một enzyme giới hạn cụ thể. Thật không may, kỹ thuật cổ điển này khá phức tạp và tốn kém. Hơn nữa, những đa hình này thường không có nhiều thông tin vì chúng không có nhiều hơn hai alen. Cần có một thế hệ RFLP mới, có thể dựa trên sự khuếch đại enzyme (PCR: phản ứng chuỗi polymerase) của các gen biểu hiện.

Một số ấn phẩm đã báo cáo cách tiếp cận DNA đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) (Cros và cộng sự, 1993; Lashermes và cộng sự, 1993, 1996c; Orozco-Castillo và cộng sự, 1994; Zezlina và cộng sự, 1999; Ruas và cộng sự , 2000). Kỹ thuật này rất hữu ích vì nó cho phép xác định các đa hình DNA ở hầu hết mọi sinh vật ngay cả khi không có thông tin nào khác về DNA đang được nghiên cứu. Nó dựa trên sự khuếch đại enzym của các đoạn DNA ngắn (100–1000 cặp bazơ) nằm giữa hai lần lặp ngược. Agwanda và cộng sự (1997) đã báo cáo trường hợp đầu tiên về mối liên quan giữa đa hình RAPD và gen T kháng bệnh berry cà phê (CBD) ở Coffea.

Kỹ thuật AFLP (đa hình chiều dài đoạn khuếch đại) đã được chứng minh là rất hữu ích: có thể thu được nhiều dải điện di (30–90 dải) trong một lần PCR và xác suất tìm thấy dải đa hình là tương đối cao. Kỹ thuật này dựa trên sự tiêu hóa DNA bởi hai enzyme cắt giới hạn, các bộ điều hợp được thêm vào ở cả hai đầu của các đoạn DNA và một số đoạn DNA được khuếch đại PCR. AFLP đã được sử dụng thành công để mô tả đặc tính của các giống (Anthony và cộng sự, 2002) cũng như trong việc đánh giá sự xâm nhập của các gen trong các giống lai (Lashermes và cộng sự, 2000b). Tuy nhiên, AFLP tương đối phức tạp và nó không cho phép xác định các dị hợp tử.

Không còn nghi ngờ gì nữa, microsatellites là nguồn đa hình hữu ích nhất và chúng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu thực vật, động vật và con người. Microsatellites là các chuỗi DNA được lặp lại song song và số lần lặp lại có thể khác nhau ở các sinh vật khác nhau của cùng một loài. Thông thường, chúng mang lại nhiều thông tin vì một locus có thể biểu hiện nhiều alen (tỷ lệ dị hợp tử cao) và vì chúng biểu hiện đồng trội, do đó cho phép xác định các dị hợp tử. Hơn nữa, các phân tích được thực hiện dễ dàng bằng PCR và một số lượng lớn mẫu có thể được phân tích với chi phí thấp và trong thời gian ngắn. Tuy nhiên, việc phát triển các xét nghiệm cho các đa hình này đôi khi rất khó khăn và tốn kém.

Bức tranh chung có thể được rút ra từ các nghiên cứu DNA đa hình là C. arabica là một loại cây trồng đặc biệt với mức độ dị hợp tử rất thấp. Điều này không có gì đáng ngạc nhiên vì cơ sở di truyền bị hạn chế và tỷ lệ tự sinh cao. Có một chút nghi ngờ rằng tỷ lệ dị hợp tử thấp này sẽ cản trở cả sự phát triển của bản đồ di truyền và việc sử dụng di truyền phân tử trong các chương trình nhân giống cho đến khi phát triển một số lượng hợp lý các đa hình thông tin.

Biểu hiện gen

Việc hoàn thành trình tự bộ gen Arabidopsis thaliana của cây mẫu (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000) đã mang lại những hiểu biết mới về sự phức tạp của bộ gen thực vật. Khoảng 25 000 gen là đủ để hỗ trợ vòng đời của một loài thực vật có hoa và không có lý do gì để tin rằng cây cà phê cần nhiều gen hơn. Ước tính này có thể đúng với C. canephora nhưng nó chắc chắn là đại diện không đầy đủ cho C. arabica, loài có số lượng nhiễm sắc thể gấp đôi và các bản sao gen trên các nhiễm sắc thể tương đồng có thể đã khác biệt đáng kể về trình tự và chức năng trong suốt quá trình tiến hóa. Dù sao đi nữa, kích thước của bộ gen arabica khiến nó có thể được phân tích hàng loạt.

Trong số các trình tự enzyme, đáng chú ý là trình tự hoàn chỉnh của N-methyltransferase, một trong những enzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa caffeine, được cung cấp bởi Kretschmar và Baumann (Số gia nhập Genebank: AF94411-AF94420). Các nghiên cứu về chuyển hóa đường (Marraccini và cộng sự, 2001b), cùng với các hợp chất thơm, có liên quan đến chất lượng cà phê cũng rất quan trọng.

Đáng chú ý, một số trình tự lặp lại giàu leucine tại vị trí liên kết nucleotide (NBS–LRR), được cho là có khả năng kháng lại nhiều loại sâu bệnh, đã được xác định (Noir và cộng sự, 2001). Đây là bước đầu tiên trong khả năng sử dụng các gen này trong các chương trình nhân giống.

Giới thiệu gen mới

Nhân giống cổ điển đã được xem xét bởi một số tác giả, bài báo của Van der Vossen (2001) là bài báo gần đây nhất. Thật không may, cây cà phê là cây lâu năm và các chương trình nhân giống mất 20-30 năm. Thời gian nhân giống dài như vậy cùng với cấu trúc di truyền đặc biệt của C. arabica (tứ bội, tỷ lệ dị hợp tử thấp và khả năng tự sinh sản) cho thấy mạnh mẽ việc sử dụng một con đường thay thế là biến đổi gen.

Các thí nghiệm chuyển đổi thành công đã được báo cáo bởi Leroy và cộng sự (1997a, 1999, 2000); Spiral và cộng sự (1999). Họ đã đưa gen cryIAc của vi khuẩn Bacillus thuringiensis vào cây arabica và cây canephora thông qua một chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được giải giáp. Phân tích 60 cây chuyển gen cho thấy mối tương quan giữa mức độ biểu hiện của gen cryIAc và tính kháng mới thu được đối với loài sâu ăn lá Perileucoptera spp.

Một thí nghiệm chuyển đổi tao nhã đã được báo cáo bởi Moisyadi và cộng sự (1998, 1999). Họ đã biến đổi cây cà phê bằng một trình tự khi một enzym dường như tham gia vào quá trình sinh tổng hợp caffeine và họ đã thu được những cây tạo ra ít hoặc không có caffeine.

Việc giới thiệu một gen mang lại khả năng kháng một trong nhiều loại sâu bệnh hại cây cà phê sẽ nâng cao sản lượng và là một trợ giúp đáng kể cho nông dân. Ngoài ra, một vấn đề quan trọng cần xem xét là thái độ của người tiêu dùng, những người có thể không sẵn sàng tiêu thụ đồ uống có nguồn gốc từ thực vật biến đổi gen.

Kết luận

Có một chút nghi ngờ rằng trong tương lai gần, nhiều EST sẽ được sản xuất và nhiều thử nghiệm đa hình sẽ được phát triển. Trên thực tế, một số cơ quan tài trợ công của Brazil đã khởi động một chương trình nghiên cứu để sản xuất 200 000 EST. Có lẽ, một số gen ‘quan trọng’ sẽ được xác định, chẳng hạn như những gen liên quan đến việc kiểm soát sự ra hoa và chín, hoặc những gen chịu trách nhiệm về khả năng kháng bệnh và sâu bệnh. Những công cụ phân tử này sẽ cho phép cải thiện cây cà phê thông qua nhân giống cổ điển. Một ví dụ điển hình là sự xâm nhập của tính kháng đối với tuyến trùng Meloidogyne exigua (Bertrand và cộng sự, 2001).

Phức tạp hơn nhiều là phương pháp di truyền để cải thiện chất lượng cà phê. Hương vị và mùi thơm có lẽ nằm dưới sự kiểm soát của một số lượng lớn gen và bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường. Tuy nhiên, không thể có được một loại cà phê chất lượng tốt nếu không có cơ sở di truyền tốt. Để tiếp cận vấn đề này chúng ta phải chờ sự phát triển của các công cụ mới. Phân tích trên toàn bộ bộ gen và phân tích microarray sẽ cho phép nghiên cứu biểu hiện gen và tương tác giữa gen với môi trường và có thể trở thành một phương pháp chẩn đoán để đánh giá chất lượng.

Tham gia cộng đồng The life of coffee để khám phá thế giới thú vị của cà phê tại ‘Link‘

Chú thích

AFLP: Đa hình độ dài đoạn khuếch đại. Kỹ thuật này dựa trên sự tiêu hóa DNA bởi hai enzyme cắt giới hạn; các bộ điều hợp được thêm vào ở cả hai đầu của các đoạn DNA và một số đoạn DNA được khuếch đại phản ứng chuỗi polymerase.

Alen: Các biến thể khác nhau của cùng một gen.

Allotetraploid: Sinh vật có bốn bộ nhiễm sắc thể, hai bộ được thừa hưởng từ một tổ tiên của một loài nhất định và hai bộ còn lại được thừa hưởng từ một loài khác nhau.

Tính đồng trội: Hai biến thể gen (alen) đồng trội khi chúng được thể hiện đồng thời và có thể nhìn thấy.

Di truyền phân ly: Cách di truyền nhiễm sắc thể hoặc gen bình thường. EST: Thẻ trình tự thể hiện. Trình tự một phần của một gen biểu hiện.

Bộ gen: Tổng số tất cả các nhiễm sắc thể và gen của một sinh vật. Nhiễm sắc thể tương đồng: Các nhiễm sắc thể mang các gen giống nhau nhưng có nguồn gốc từ hai cây tổ tiên của các loài khác nhau.

Homozygosity: Tính đồng nhất của các alen.

ITS: Bộ đệm được sao chép nội bộ. Phần cụ thể của DNA nằm giữa các gen mã hóa cho ARN ribôxôm.

Microarray: Kỹ thuật lai tạo để trực quan hóa biểu hiện bộ gen. Kính hiển vi: Các chuỗi DNA được lặp lại song song.

NBS-LRR: Lặp lại giàu leucine tại vị trí gắn kết nucleotide. Loại gen mang lại khả năng kháng bệnh và sâu bệnh.

PCR: Phản ứng chuỗi polymerase. Phản ứng trong ống nghiệm cho phép khuếch đại các gen cụ thể hoặc các đoạn DNA.

Sinh vật đa bội: Sinh vật chứa nhiều hơn hai bộ nhiễm sắc thể.

Mồi: Các đoạn DNA ngắn cho phép bắt đầu quá trình PCR.

RAPD: DNA đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên. khuếch đại enzyme của các đoạn DNA ngắn nằm giữa hai lần lặp ngược.

RFLP: Đa hình chiều dài đoạn giới hạn. sự biến đổi của vị trí nhận biết của một enzyme cắt giới hạn.

Enzym cắt giới hạn: Enzym có khả năng cắt DNA tại hoặc gần mức xác định trình tự.

Southern blots: Kỹ thuật sắc ký để phân lập và xác định- tạo ra các đoạn DNA cụ thể.

Nguồn tham khảo

Acun ̆a R., Bassu ̈ner R., Beilinson V., Cortina H., Cadena G., Montes V. and Nielsen N.C. (1999) Coffee seeds contains 11S storage proteins. Physiol. Plant. 105, 122–131. 

Aerts R.J. and Baumann T.W. (1994) Distribution and utilization of chlorogenic acid in Coffea seedlings. J. Experiment. Botany 45, 497–503. 

Agwanda C.O., Lashermes P., Trouslot P., Combes M.C. and Charrier A. (1997) Identification of RAPD markers for resistance to coffee berry disease, Colletotricum kahawae, in arabica coffee. Euphytica 97, 241–248.

Alborn T., Turlings T.C.J., Jones T.H., Stenhagen G. and Loughrin J.H. (1997) An elicitor of plant volatiles from beet army worm oral secretion. Science 276, 945–949.

Alvim P. de T. (1973) Factors affecting flowering of coffee. J. Plant. Crops 1, 37–43.

Amorim H.V., Teixeira A.A., Moraes R.S., Reis A.J., Pimentel-Gomes F. and Malavolta E. (1973) Studies on the mineral nutrition of coffee. XXVII. Effect of N, P and K fertilization on the macro- and micronutrients of coffee fruits and on beverage quality. Ann. Esc. Sup. Agric. LQ (Piracicaba), 20, 323–333 (in Portuguese). 

Anthony F., Combes M.C., Astorga C., Bertrand B., Graziosi G. and Lashermes P. (2002) The origin of cultivated Coffea arabica L. varieties revealed by AFLP and SSR markers. Theor. Appl. Genet. 104, 894–900. 

Anzueto F., Bertrand B., Sarah J.L., Eskes A.B. and Decazy B. (2001) Resistance to Meloidogyne incognita in Ethiopian Coffea arabica: detection and study of resistance transmission. Euphytica 118, 1–8. 

Ashihara H. and Crozier A. (1999) Biosynthesis and metabolism of caffeine and related purine alkaloids in plants. Adv Botanical Res. 30, 117–205.

Bade-Wegner H., Bending I., Holscher W. and Wollmann R. (1997) Volatile compounds associated with the over-fermented flavour defects. Proc. 17th ASIC Coll., pp. 176–182. 

Bade-Wegner H., Holscher W. and Vitzhum O.G. (1993) Quantification of 2- methylisoborneol in roasted coffee by GC-MS. Proc. 15th ASIC Coll., pp. 537–544. 

Balzer H.H (2001) Acids in coffee. In R.J. Clarke and O.G.Vitzthum (eds), Coffee: Recent Developments. Oxford: Blackwell Science, pp. 18–32. Barboza C.A. and Ramirez-Martinez J.R. (1991) Antocianinas en pulpa de cafe ́ del cultivar Bourbon rojo. Proc. 14th ASIC Coll., pp. 272–276. 

Bardner R. (1985) Pest control. In M.N. Clifford and K.C. Willson (eds), Coffee: Botany, Biochemistry and Production of Beans and Beverage. London: Croom Helm, pp. 208–218.

Baumann T.W. and Gabriel H. (1984) Metabolism and excretion of caffeine during germination of Coffea arabica L. Plant Cell Physiol. 25, 1431–1436. 

Baumann T.W. and Seitz R. (1992) Coffea. In R. Ha ̈nsel, K. Keller, H. Rimpler and G. Schneider (eds), Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, Volume 4. Berlin: Springer, pp. 926–940. 

Baumann T.W., Sondahl M.R., Mo ̈sli Waldhauser S.S. and Kretschmar J.A. (1998) Non-destructive analysis of natural variability in bean caffeine content of Laurina coffee. Phytochem. 49, 1569–1573. 

Bellachew B. (1997) Arabica coffee breeding in Ethiopia: a review. Proc. 17th ASIC Coll., pp. 406–414. 

Beretta M.J.G., Harakawa R., Chagas C.M., Derrick K.S., Barthe G.A., Ceccardi T.L., Lee R.F., Paradela-F. O., Sugimori M. and Ribeiro I.A. (1996) First report of Xylella fastidiosa in coffee. Plant Dis. (St Paul) 80, 821–826. 

Bergamin J. (1963) Pests and diseases in coffee. In C.A. Krug et al. (eds), Cultivation and Fertilization of Coffee. Sao ̃ Paulo: Inst. Bras. Potassa, pp. 127–141 (in Portuguese). 

Berthaud J. (1980) L’incompatibilite ́ chez Coffea canephora: me ́thode de test et de ́te ́rminisme ge ́ne ́tique. Cafe ́ Cacao The ́ 24, 267–274.

Berthaud J. and Charrier A. (1988) Genetic resources of Coffea. In R.J. Clarke and R. Macrae (eds), Coffee: Volume 4 – Agronomy. London: Elsevier Applied Science, pp. 1–42. 

Bertrand B., Aguilar G., Santacreo R., Anthony F., Etienne H., Eskes A.B. and Charrier A. (1997) Comportement d’hybrides F1 de Coffea arabica pour la vigueur, la production et la fertilite ́ en Ame ́rique Centrale. Proc. 17th ASIC Coll., pp. 415–423. 

Bertrand B., Anthony F. and Lashermes P. (2001) Breeding for resistance to Meloidogyne exigua of Coffea arabica by introgression of resistance genes of Coffea canephora. Plant Pathol. 50, 637–643. 

Bertrand B., Guyot B., Anthony F., Selva J.C., Alpizar J.M., Etienne H. and Lashermes P. (2004) Selection can avoid accompanying the intro- gression of Coffea canephora gene of resistance with a drop in beverage quality, 20th ASIC Coll. In press. 

Bertrand B., Pen ̃a Duran M.X., Anzueto F., Cilas C., Etienne H., Anthony F. and Eskes A.B. (2000) Genetic study of Coffea canephora coffee tree resistance to Meloidogyne incognita nematodes in Guatemala and Meloidogyne sp. nematodes in El Salvador for selection of rootstock varieties in Central America. Euphytica 113, 79–86. 

Bettencourt A.J. and Rodrigues C.J. (1988) Principles and practice of coffee breeding for resistance to rust and other diseases. In R.J. Clarke and R. Macrae (eds), Coffee: Volume 4 – Agronomy. London: Elsevier Applied Science, pp. 199–234. 

Bhat S.S., Daivasikamani S. and Naidu R. (1995) Tips on effective management of black rot disease in coffee. Indian Coffee 59 (8), 3–5. 

Bouharmount, J. (1959) Recherche sur les affinite ́s chromosomiques dans le genre Coffea. INEAC Se ́ries Sci. 77, Brussels. 

Bradbury A.G.W. (2001) Chemistry I: Non-volatile compounds, 1A – carbohydrates. In R.J. Clarke and O.G. Vitzthum (eds), Coffee – Recent Developments. Oxford: Blackwell Science, pp. 1–17. 

Bridson D.M. (1994) Additional notes on Coffea (Rubiaceae) from Tropical East Africa. Kew Bulletin 49 (2), 331–342. 

Bridson D.M. and Verdcourt B. (1988) Rubiaceae (Part 2). In R.M. Polhill (ed.), Flora of Tropical East Africa. Rotterdam: Balkema, pp. 703–723. 

Buchanan R.L., Tice G. and Marino D. (1981) Caffeine inhibition of ochratoxin A production. J. Food Sci. 47, 319–321. 

Cannell M.G.R. (1985) Physiology of the coffee crop. In M.N. Clifford and K.C. Willson (eds), Coffee: Botany, Biochemistry and Production of Beans and Beverage. London: Croom Helm, pp. 108–124. 

Capot J. (1972) L’ame ́lioration du cafe ́ier robusta en Coˆte d’Ivoire: Les hybrides Arabusta. Cafe ́ Cacao The ́ 16, 3–18 and 114–126. 

Carvalho A. (1946) Geographic distribution and botanical classification of genus Coffea with special reference to arabica species. Bull. Superint. Serv. Cafe ́ 23, 3–33 (in Portuguese). 

Carvalho A. (1988) Principles and practice of coffee plant breeding for productivity and quality factors: Coffea arabica. In R.J. Clarke and R. Macrae (eds), Coffee: Volume 4 – Agronomy. London: Elsevier Applied Science, pp. 129–165. 

Carvalho A.C., Ferwerda F.P. et al. (1969). Coffee. In F.P. Ferwerda and F. Wit (eds), ‘Outlines of perennial crop breeding in the tropics’, Miscellaneous papers No. 4, Agricultural University, Wageningen, The Netherlands, pp. 189–241. 

Charrier A. (1978) La structure ge ́ne ́tiquedes cafe ́iers spontane ́s de la re ́gion malgache (Mascarocoffea). Me ́moires ORSTOM 87, Orstom Ed., Paris. 

Charrier A. and Eskes A.B. (1997) Les Cafe ́iers. In A. Charrier, M. Jacquot, S. Hamon and D. Nicolas (eds), ‘L’Ame ́lioration des plantes tropicales’, pp. 171–196. Repe`res CIRAD and ORSTOM Montpellier (English edition, 2002). 

Chevalier A. (1947) Les cafe ́iers du globe. III. Syste ́matique des cafe ́iers et faux cafe ́iers, maladies et insectes nuisibles. In Encyclope ́die biologique no. 28. Paris: Paul Le Chevalier. 

Clarke R.J. and Vitzthum O.G. (2001) Coffee – Recent Developments. Oxford: Blackwell Science. 

Combes M.C., Andrzejewski S., Anthony F., Bertrand B., Rovelli P., Graziosi G. and Lashermes P. (2000) Characterisation of micro-satellite loci in Coffea arabica and related coffee species. Mol. Ecol. 9, 1178–1180. 

Couturon E. (1980) Le maintien de la viabilite ́ des graines de cafe ́iers par le controˆle de leur teneur en eau et de la tempe ́rature de stockage. Cafe ́ Cacao The ́ 24, 27–31. 

Couturon E., Lashermes P. and Charrier A. (1998) First intergeneric hybrids (Psilanthus ebracteolatus Hiern x Coffea arabica L.) in coffee trees. Canadian J. Botany 76, 542–546. 

Cros J., Combes M.C., Chabrillange N., Duperray C., Monnot des Angles A. and Hamon S. (1995) Nuclear DNA content in the subgenus Coffea (Rubiacee): inter- and intra-specific variation in African species. Canadian J. Botany 73, 14–20. 

Cros J., Lashermes P., Marmey F., Anthony F., Hamon S. and Charrier A. (1993) Molecular analysis of genetic diversity and phylogenetic relationship in Coffea. Proc. 14th ASIC Coll., pp. 41–46. 

Cros J., Trouslot P., Anthony F., Hamon S. and Charrier A. (1998) Phylogenetic analysis of chloroplast DNA variation in Coffea L. Mol. Phylogenet. Evol. 9, 109–117. 

de Kochko A., Louarn J., Hamon P., Hamon S. and Noirot M. (2001) Coffea genome structure and relationship with evolution. Proc. 19th ASIC Coll., CD-ROM. 

Dedecca D.M. (1957) Anatomy and antogenetic development of Coffea arabica L. var. Typica Cramer. Bragantia 16, 315–366.

Dentan E. (1985) The microscopic structure of the coffee bean. In M.N. Clifford and K.C. Willson (eds), Coffee: Botany, Biochemistry, and Production of Beans and Beverage. London: Croom Helm, pp. 284–304. 

Detzel A. and Wink M. (1993) Attraction, deterrence or intoxication of bees. Chemoecology 4, 8–18. 

Dicke M. and Van Loon J.J.A. (2000) Multitrophic effects of herbivore- induced plant volatiles in an evolutionary context. Entomol. Experimentalis Applicata 97, 237–249.

Edwards P.J. (1992) Resistance and defence: the role of secondary plant substances. In P.G. Ayres (ed.), Pest and Pathogens. Plant Responses to Foliar Attack. Environmental Plant Biology Series, Abingdon: Bios Scientific Publishers, pp. 69–84. 

Eskes A.B. (1989) Resistance. In A.C. Kushalappa and A.B. Eskes (eds), Coffee Rust: Epidemiology, Resistance and Management. Boca Raton, FL: CRC Press, pp. 171–291. 

Etienne H., Anthony F., Dussert S., Fernandez D., Lashermes P. and Bertrand B. (2002) Biotechnological applications for the improvement of Coffee (Coffea arabica L.). Vitro Cell. Dev. Biol. – Plant, 38, 129–138. 

Ferreira M.E. and Cruz M.C.P. (1988) Symposium on Micronutrients in Agriculture: I. Jaboticabal. Sao ̃ Paulo, Brazil (in Portuguese). 

Flood J. and Brayford D. (1997) Re-emergence of Fusarium wilt of coffee in Africa. Proc. 17th ASIC Coll., pp. 621–628. 

Fonseca H. and Gutierrez L.E. (1971) Study on content and composition of oil from some coffee varieties. Ann. Esc. Sup. LQ, Piracicaba 18, 313–322 (in Portuguese). 

Fraenkel G.S. (1959) The raison d’eˆtre of secondary plant substances. Science 129, 1466–1470. 

Frischknecht P.M., Eller B.M. and Baumann T.W. (1982) Purine alkaloid formation and CO2 gas exchange in dependence of development and of environmental factors in leaves of Coffea arabica. Planta 156, 295–301. 

Frischknecht P.M., Ulmer-Dufek J. and Baumann T.W. (1986) Purine alkaloid formation in buds and developing leaflets of Coffea arabica: expression of an optimal defence strategy? Phytochem. 25, 613–616. 

Full G., Lonzarich V. and Suggi Liverani F. (1999) Differences in chemical composition of electronically sorted green coffee beans. Proc. 17th ASIC Coll., pp. 35–42. 

Gimenez-Martin G., Lopez-Saez J.F., Moreno P. and Gonzalez-Fernandez A. (1968) On the triggering of mitosis and the division cycle of polynucleate cells. Chromosoma 25, 282–296.

Golden K.D., John M.A. and Kean E.A. (1993) ß-Galactosidase from Coffea arabica and its role in fruit ripening. Phytochemistry 34, 355–360.

Grace S.C. and Logan B.A. (2000) Energy dissipation and radical scavenging by the plant phenylpropanoid pathway. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 355, 1499–1510. 

Guerreiro Filho O. (1992) Coffea racemosa Lour – une revue. Cafe ́ Cacao The ́ 36, 171–186. 

Guerreiro Filho O., Denoit P., Pefercen M., Decazy B., Eskes A.B. and Frutos R. (1998) Susceptibility to the coffee leaf miner (Perileucoptera spp.) to Bacillus thuringiensis d-endotoxins: a model for transgenic perennial crops resistant to endocarpic insects. Curr. Microbiol. 36, 175–179. 

Harborne J.B. (2001) Twenty-five years of chemical ecology. Natl Prod. Rep. 18, 361–379. 

Hartmann T. (1996) Diversity and variability of plant secondary metabolism: a mechanistic view. Entomol. Experimentalis Applicata 80, 177–188. 

Herrera J.C., Combes M.C., Anthony F., Charrier A. and Lashermes P. (2002) Introgression into the allotetraploid coffee (Coffea arabica L.): segregation and recombination of the C. canephora genome in the tetraploid interspecific hybrid (C. arabica x C. canephora). Theor. Appl. Genet. 104, 661–668. 

Hollingsworth R.G., Armstrong J.W. and Campbell E. (2002) Caffeine as a repellent for slugs and snails. Nature 417, 915–916. 

Holscher W. (1996) Comparison of some aroma impact compounds in roasted coffee and coffee surrogates. In A.J. Taylor and D.S. Mottram (eds), Flavour Science, Recent Developments. Cambridge: The Royal Society of Chemistry, pp. 239–244. 

Horman I. and Viani R. (1972) The nature and conformation of the caffeine- chlorogenate complex of coffee. J. Food Sci. 37, 925–927. 

ICO (2002) Annual Statistics on Coffee Production and International Trade. London: International Coffee Organization. 

Illy E. (1997) How science can help to improve coffee quality. Proc. 17th ASIC Coll., pp. 29–33. 

Illy A. and Viani R. (eds) (1995) The plant composition. In A. Illy and R. Viani (eds), Espresso Coffee. The Chemistry of Quality. London: Academic Press, pp. 23–38. 

ITC (2002) Coffee, an Exporter’s Guide. International Trade Centre. Product and marketing development. UNCTAD CNUCED, WTO OMC. Geneva. 

Kammacher P. and Capot J. (1972) Sur les relations caryologiques entre Coffea arabica et C. canephora. Cafe` Cacao The 16, 289–294.

Kappeler A.W. (1988) Der Purinalkaloid-Chlorogensa ̈ure-Komplex. Seine physikalisch-chemische Natur und seine Bedeutung in der Gewebekultur und in den Bla ̈ttern von Coffea arabica L. Inaugural Dissertation. Institut fu ̈r Pflanzenbiologie, Universita ̈t Zu ̈rich. 

Keller H., Wanner H. and Baumann T.W. (1972) Kaffeinsynthese in Fru ̈chten und Gewebekulturen von Coffea arabica. Planta 108, 339–350. 

Kende H. (1960) Untersuchungen u ̈ber die Biosynthese und Bedeutung von Trigonellin in Coffea arabica. Berichte Schweiz. Botanisch. Ges. 70, 232–267. 

Kessler A. and Baldwin T. (2001) Defensive function of herbivore-induced plant volatile emissions in nature. Science 291, 2141–2144. 

Kihlman B.A. (1977) Caffeine and Chromosomes. Amsterdam: Elsevier. Kretschmar J. and Baumann T. (1999) Caffeine in citrus flowers. Phytochem. 52, 19–23.

Krug C.A. and Carvalho A. (1951) The genetics of Coffea. Adv. Genet. 4, 127–158.

Krug C.A. and Mendes A.J.T. (1940) Cytological observation in Coffea. J. Genet. 39, 189–203.

Krug C.A. and de Poerck R.A. (1968) World Coffee Survey. FAO Agricultural Studies no. 76, Rome.

Ky C.L., Barre P., Lorieux M., Trouslot P., Akaffou S., Louarn J., Charrier A., Hamon S. and Noirot M. (2000) Interspecific genetic linkage map, segregation distortion and genetic conversion in coffee (Coffea sp.). Theor. Appl. Genet. 101, 669–676. 

Ky C.L., Louarn J., Guyot B., Charrier A., Hamon S. and Noirot M. (1999) Relations between and inheritance of chlorogenic acid contents in an interspecific cross between Coffea pseudozanguebariae and Coffea liberica var. ‘dewevrei’. Theor. Appl. Genet. 98, 628–637. 

Lashermes P., Cros J., Marmey P. and Charrier A. (1993) Use of random amplified DNA markers to analyse genetic variability and relationship of Coffea species. Genet. Resour. Crop Evol. 40, 91–99. 

Lashermes P., Couturon E., Moreau N., Pailard M. and Louarn J. (1996a) Inheritance and genetic mapping of self-incompatibility in Coffea canephora. Theoret. Appl. Genet. 93, 458–462. 

Lashermes P., Cros J., Combes M.C., Trouslot P., Anthony F., Hamon S. and Charrier A. (1996b) Inheritance and restriction fragment length polymorphism of chloroplast DNA in the genus Coffea L. Theor. Appl. Genet. 93, 626–632. 

Lashermes P., Trouslot P., Combes M.C. and Charrier A. (1996c) Genetic diversity for RAPD markers between cultivated and wild accessions of Coffea arabica. Euphitica 87, 59–64. 

Lashermes P., Combes M.C., Trouslot P. and Charrier A. (1997) Phylogenetic relationships of coffee tree species (Coffea L.) as inferred from ITS sequences of nuclear ribosomal DNA. Theoret. Appl. Genet. 94, 947–955. 

Lashermes P., Combes M.C., Robert J., Trouslot P, D’Hont A., Anthony F. and Charrier, A. (1999) Molecular characterization and origin of the Coffea arabica L. genome. Mol. Gen. Genet. 261, 259–266. 

Lashermes P., Paczek V., Trouslot P., Combes M.C., Couturon F. and Charrier A. (2000a) Single-locus inheritance in the allotetraploid Coffea arabica L. and interspecific hybrid C. arabica x C. canephora. J. Heredity 91, 81–85. 

Lashermes P., Andrzejewki S., Bertrand B., Combes M.C., Dussert S., Graziosi G., Trouslot P. and Anthony F. (2000b) Molecular analysis of introgressive breeding in coffee (Coffea arabica L.). Theor. Appl. Genet. 100, 139–146. 

Lashermes P., Combes M.C., Prakash N.S., Trouslot P., Lorieux M. and Charrier A. (2001) Genetic linkage map of Coffea canephora: effect of segregation distortion and analysis of recombination rate in male and female meioses. Genome 44, 589–596.

Leroy J.F. (1980) Evolution et taxoge ́nese chez les cafe ́iers. Hypothese sur leur origine. CR Acad. Sci. Paris 291, 593–596. 

Leroy T., Henry A.M., Royer M., Altosaar I., Frutos R., Duris D. and Philippe R. (2000) Genetically modified coffee plants expressing the Bacillus thuringiensis cry1Ac gene for resistance to leaf miner. Plant Cell Reports 19, 382–389. 

Leroy T., Montagnon C., Cilas C., Yapo A., Charrier A. and Eskes A.B. (1997b) Reciprocal recurrent selection applied to Coffea canephora Pierre. III. Genetic gains and results of first cycle intergroup crosses. Euphytica 95, 347–354.

Leroy T., Philippe R., Royer M., Frutos R., Duris D., Dufour M., Jourdan I., Lacombe C. and Fenouillet C. (1999) Genetically modified coffee trees for resistance to coffee leaf miner. Analysis of gene expression, resistance to insects and agronomic value. Proc. 18th ASIC Coll., pp. 332–338. 

Leroy T., Royer M., Paillard M., Berthouly M., Spiral J., Tessereau S., Legavre T. and Altosaar I. (1997a) Introduction de ge`nes d’inte ́reˆt agronomique dans l’espe`ce Coffea canephora Pierre par transformation avec Agrobacterium sp. Proc. 17th ASIC Coll., pp. 439–446. 

Marraccini P., Allard C., Andre ́ M-L., Courjault C., Gaborit C., LaCoste N., Meunier A., Michaux S., Petit V., Priyono P., Rogers J.W. and Deshayes A. (2001a) Update on coffee biochemical compounds, protein and gene expression during bean maturation and in other tissues. Proc. 19th ASIC Coll., CD-ROM. 

Marraccini P., Deshayes A., Pe ́tiard V. and Rogers W.J. (1999) Molecular cloning of the complete 11S seed storage protein gene of Coffea arabica and promoter analysis in transgenic tobacco plants. Plant Physiol. Biochem. 37, 273–282.

Marraccini P., Rogers W.J., Allard C., Andre M.L., Caillet V., Lacoste N., Lausanne F., Michaux S. (2001b) Molecular and biochemical character- ization of endo-beta-mannanases from germinating coffee (Coffea arabica) grains. Planta 213, 296–308. 

Martin R., Lilley T.H., Falshaw P., Haslam E., Begley M.J. and Magnolato D. (1987) The caffeine-potassium chlorogenate molecular complex. Phytochemistry 26, 273–279. 

Mayer F., Czerny M. and Grosch W. (1999) Influence of provenance and roast degree on the composition of potent odorantes in arabica coffees. Eur. Food Res. Technol. 209, 242–250. 

McCready S.J., Osman F. and Yasui A. (2000) Repair of UV damage in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Mutat. Res. 451, 197–210. 

Mettulio R., Rovelli P., Antony F., Anzueto F., Lashermes P. and Graziosi G. (1999) Polymorphic microsatellites in Coffea arabica. Proc. 18th ASIC Coll., pp. 344–347. 

Minorsky P.V. (2002) The hot and the classic. Trigonelline: A diverse regulator in plants. Plant Physiol. 128, 7–8. 

Mitchell H.W. (1988) Cultivation and harvesting of the arabica coffee tree. In R.J. Clarke and R. Macrae (eds), Coffee: Volume 4 – Agronomy. London: Elsevier Applied Science, pp. 43–90. 

Moisyadi S., Neupane K.R. and Stiles J.I. (1998) Cloning and characterisation of a cDNA encoding xantosine-N7-methyltransferase from coffee (Coffea arabica). Acta Hort. 461, 367–377. 

Moisyadi S., Neupane K.R. and Stiles J.I. (1999) Cloning and characterisation of xantosine-N7-methyltransferase, the first enzyme of the caffeine biosynthetic pathway. Proc. 18th ASIC Coll., pp. 327–331. 

Montagnon C., Leroy T. and Eskes A.B. (1998a) Ame ́lioration varie ́tale de Coffea canephora. I. Crite`res et me ́thodes de se ́lection. Plantations, Recherche, De ́v. 5 (1), 18–33. 

Montagnon C., Leroy T. and Eskes A.B. (1998b) Ame ́lioration varie ́tale de Coffea canephora. II. Les programmes de se ́lection et leurs re ́sultats. Plantations, Recherche, De ́v. 5 (2), 89–98. 

Moreno G., Moreno E. and Cadena G. (1995) Bean characteristics and cup quality of the Colombia variety (Coffea arabica) as judged by interna- tional tasting panels. Proc. 16th ASIC Coll., pp. 574–578. 

Mo ̈sli Waldhauser S.S. and Baumann T.W. (1996) Compartmentation of caffeine and related purine alkaloids depends exclusively on the physical chemistry of their vacuolar complex formation with chlorogenic acids. Phytochem. 42, 985–996.

Mo ̈ sli Waldhauser S.S., Kretschmar J.A. and Baumann T.W. (1997) N-methyltransferase activity in caffeine biosynthesis: biochemical characterisation and time course during leaf development of Coffea arabica. Phytochem. 44, 853–859. 

Nathanson J.A. (1984) Caffeine and related methylxanthines: possible naturally occurring pesticides. Science 226, 184–187. 

Nehlig A. (1999) Are we dependent upon coffee and caffeine? A review on human and animal data. Neurosci Biobehav. Rev. 23, 563–576. 

Njoroge S.M., Morales A.F., Kari P.E. and Owuor J.B.O. (1990) Comparative evaluation of the flavour qualities of Ruiru II and SL28 cultivars of Kenya arabica coffee. Kenya Coffee 55 (643), 843–849. 

Noir S., Combes M.C., Anthony F. and Lashermes P. (2001) Origin, diversity and evolution of NBS disease-resistance gene homologues in coffee trees (Coffea L.). Mol. Gen. Genomics 265, 654–662. 

Orozco-Castillo C., Chalmes K.J., Waugh R. and Powell W. (1994) Detection of genetic diversity and selective gene introgression in coffee using RAPD markers. Theor. Appl. Genet. 87, 934–940. 

Paillard M., Lashermes P. and Pe ́tiard V. (1996) Construction of a molecular linkage map in coffee. Theor. Appl. Genet. 93, 41–47. 

Pallavicini A., Del Terra L., De Nardi B., Rovelli P. and Graziosi G. (2001) A catalogue of genes expressed in Coffea arabica L. Proc. 19th ASIC Coll., CD-ROM. 

Pendergrast M. (1999) Uncommon Grounds: the History of Coffee and How It Transformed Our World. New York: Basic Books, Perseus Books Groups. Pichersky E. and Gershenzon J. (2002) The formation and function of plant volatiles: perfumes for pollinator attraction and defense. Curr. Opin. 

Plant Biol. 5, 237–243.
Prakash S.N., Combes M.C., Naveen S.K., Graziosi G. and Lashermes P. 

(2001) Application of DNA marker technologies in characterizing genome diversity of selected coffee varieties and accessions from India. Proc. 19th ASIC Coll., CD-ROM. 

Raina S.N., Mukai Y. and Yamamoto M. (1998) In situ hybridization identifies the diploid progenitor species of Coffea arabica (Rubiaceae). Theoret. Appl. Genet. 97, 1204–1209. 

Rhoades D.F. (1979) Evolution of plant chemical defense against herbivores. In Herbivores. New York: Academic Press, pp. 3–54. 

Ribas A.F., Kobayashi A.K., Bespalhok Pilho J.C., Galva ̃o R.M., Pereira L.F.P. and Vieira L.G.E. (2001) Trasformac ̧a ̃o gene`tica de cafe` mediada por Agrobacterium tumefaciens. II Simposio de Pesquisa dos Cafes do Brasil, Victoria ES, pp. 420–428. 

Rizvi S.J.H., Mukerji D. and Mathur S.N. (1981) Selective phyto-toxicity of 1,3,7-trimethylxanthine between Phaseolus mungo and some weeds. Agric. Biol. Chem. 45, 1255–1256. 

Rogers W.J., Be ́zard G., Deshayes A., Pe ́tiard V. and Marraccini P. (1999a) Biochemical and molecular characterization and expression of the 11S- type storage protein from Coffea arabica endosperm. Plant Physiol. Biochem. 37, 261–272.

Rogers W.J., Michaux S., Bastin M. and Bucheli P. (1999b) Changes to the content of sugars, sugar alcohols, myo-inositol, carboxylic acids and inorganic anions in developing grains from different varieties of robusta (Coffea canephora) and arabica (C. arabica) coffees. Plant Sci. 149, 115–123. 

Rovelli P., Mettulio R., Anthony F., Anzueto F., Lashermes P. and Graziosi G. (2000) Microsatellites in Coffea arabica L. In T. Sera, C. R. Soccol, A. Pandey and S. Roussos (eds), Coffee Biotechnology and Quality. Dordrecht: Kluwer Academic, pp. 123–133. 

Ruas P.M., Diniz L.E.C., Ruas C.F. and Sera T. (2000) Genetic polymorphism in species and hybrids of Coffea revealed by RAPD. In T. Sera, C. R. Soccol, A. Pandey and S. Roussos (eds), Coffee Biotechnology and Quality. Dordrecht: Kluwer Academic, pp. 187–195. 

Schiestl F.P. and Ayasse M. (2001) Post-pollination emission of a repellent compound in a sexually deceptive orchid: a new mechanism for maximising reproductive success? Oecologia 126, 531–534. 

Schiestl F.P., Ayasse M., Paulus H.F., Lofstedt C., Hansson B.S., Ibarra F. and Francke W. (1999) Orchid pollination by sexual swindle. Nature 399, 421–422. 

Shimizu M.M. and Mazzafera P. (2000) A role for trigonelline during imbibition and germination of coffee seeds. Plant Biol. 2, 605–611. 

Sondahl M.R. and Baumann T.S. (2001) Agronomy II: development and cell biology. In R.J. Clarke and O.G. Vitzthum (eds), Coffee – Recent Developments. Oxford: Blackwell Science, pp. 202–223.

Sondahl M.R. and Sharp W.R. (1979) Research in Coffea spp. and applications of tissue culture methods. In W.R. Sharp et al. (eds), Plant Cell and Tissue Culture. Principles and Applications. Columbus, OH: Ohio State University Press, pp. 527–584.

Sondheimer E. (1964) Chlorogenic acid and related depsides. Botanical Rev. 30, 667–712.

Sondheimer E., Covitz F. and Marquise ́e M.J. (1961) Association of naturally occurring compounds, the chlorogenic acid-caffeine complex. Arch. Biochem. Biophys. 93, 63–71.

Speer K. and Kolling-Speer I. (2001) Lipids. In R.J. Clarke and O.G. Vitzthum (eds), Coffee – Recent Developments. Oxford: Blackwell Science, pp. 33–49.

Spiral J., Leroy T., Paillard M. and Pe ́tiard V. (1999) Transgenic coffee (Coffea species). In Y.P.S. Bajaj (eds), Biotechnology in Agriculture and Forestry. Berlin: Springer, pp. 55–76.

Srinivasan C.S., Prakash N.S., Padma Jyothi D., Sureshkumar V.B. and Subbalakshmi V. (2000) Coffee cultivation in India. In T. Sera, C.R. Soccol, A. Pandey and S. Roussos (eds), Coffee Biotechnology and Quality. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, pp. 17–26. 

Stocker H. (1976) Epikutikula ̈re Blattwachse bei Coffea. Vera ̈nderungen wa ̈hrend der Blattentwicklung; Blattwachse als chemosystematisches Merkmal. Inaugural Dissertation, Institu ̈ t fu ̈ r Pflanzenbiologie, Universita ̈t Zu ̈rich. 

Taylor E., McGirr R., Bates J., Lee D., Rovelli P., Graziosi G. and Donini P. (2002) Modern technology for traceability and authenticity of coffee throughout food processing. Plant, Animal and Microbe Genomes X Conference, 12–16 January, San Diego, p. 174. 

The Arabidopsis Genome Initiative (2000) Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature 408, 796–815. 

Turlings T.C.J., Tumlinson J.H. and Lewis W.J. (1990) Exploitation of herbivore-induced plants odors by host-seeking parasitic wasps. Science 250, 1251–1253. 

Urbaneja G., Ferrer J., Paez G., Arenas L. and Colina G. (1996) Acid hydrolysis and carbohydrates characterization of coffee pulp. Renewable Energy 9, 1041–1044. 

Valio I.F.M. (1976) Germination of coffee seeds (Coffea arabica L. cv. Mundo Novo). J. Exp. Bot. 27, 983–991. 

Van der Vossen H.A.M. (1980) Methods of preserving the viability of coffee seeds in storage. Kenya Coffee 45, 31–35. 

Van der Vossen H.A.M. (1985) Coffee selection and breeding. In M.N. Clifford and K.C. Willson (eds), Coffee: Botany, Biochemistry and Production of Beans and Beverage. London: Croom Helm, pp. 48–96. 

Van der Vossen H.A.M. (1997) Quality aspects in arabica coffee breeding programmes in Africa. Proc. 17th ASIC Coll., pp. 430–438. 

Van der Vossen H.A.M. (2001) Coffee breeding practices. In R.J Clarke and O.G. Vitzthum (eds), Coffee – Recent Developments. Oxford: Blackwell Science, pp. 184–201. 

Van der Vossen H.A.M. and Browning G. (1978) Prospects of selecting genotypes of Coffea arabica which do not require tonic sprays of fungicide for increased leaf retention and yield. J. Horticult. Sci. 53, 225–233. 

Van der Vossen H.A.M. and Walyaro D.J. (1981) The coffee breeding programme in Kenya: a review of progress made since 1971 and plan of action for the coming years. Kenya Coffee 46, 113–130. 

Van der Vossen H.A.M., Soenaryo and Mawardi S. (2000) Coffea L. In H.A.M. van der Vossen and M. Wessel (eds), Plant Resources of South- East Asia no.16. Stimulants. Leiden: Backhuys Publishers, pp. 66–74. 

Viani R. (1988) Physiologically active substances in coffee. In R.J. Clarke and R. Macrae (eds), Coffee: Volume 3 – Physiology. London: Elsevier Applied Science, pp. 1–31. 

Vitzthum O.G., Weisemann C., Becker R. and Kohler H.S. (1990) Identification of an aroma key compound in robusta coffees. Cafe ́ Cacao The ́ 34, 27–33. 

Willson K.C. (1985) Mineral nutrition and fertilizer needs. In M.N. Clifford and K.C. Willson (eds), Coffee: Botany, Biochemistry and Production of Beans and Beverage. London: Croom Helm, pp. 135–156. 

Wrigley G. (1988) Coffee (Tropical Agriculture Series). Harlow: Longman Scientific and Technical. 

Zezlina S., Soranzio M., Rovelli P., Krieger M.A., Sondhal M.R. and Graziosi G. (1999) Molecular characterisation of the cultivar Bourbon LC. Proc. 18th ASIC Coll., CD-ROM.